CITOMETRÍA DE FLUJO

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INTRODUCCIÓN

El termino Citometría de Flujo se define como una tecnología que mide células a su paso por un fluido en una serie de detectores, es decir, una suspensión celular se inyecta al fluido laminar donde las células pasan una tras otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo laser, cuando este rayo incide en una célula la luz de excitación sale hacia delante y hacia los lados de la célula y esto genera información, la luz dispersada hacia delante posee información sobre el tamaño de la célula, la luz dispersada hacia los lados provee información sobre la granularidad, tamaño y morfología celular. Si la célula va marcada con un fluoróforo o es autofluorescente, la luz fluorescente se procesa a través de los distintos fotomultiplicadores en el sistema procesador de datos y los resultados son analizados por el software del citómetro.

La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población celular o de las subpoblaciones que la componen.

Figura 1.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Los citómetros pueden medir con alta sensibilidad la dispersión de luz y la fluorescencia emitida por las células o partículas presentes en una mezcla heterogénea, para esto las células deben estar suspendidas de forma uniforme en un medio, el cual debe ser isotónico, aprox. un pH 7.4 y para una máxima eficiencia a una concentración de 10e5-10e6 células/ml.

El primer paso para la preparación de la muestra consiste en la obtención o producción de las células en suspensión y el segundo en el mantenimiento de las funciones y propiedades celulares, sin embargo cuando usamos o desarrollamos un protocolo es importante siempre comprobar la preparación mediante microscopia, incluidos los controles y asegurarse que estamos trabajando con un método reproducible y sin artefactos.

Cuando analizamos algunas características o funciones celulares (exclusión de muertas, fagocitosis, citotoxicidad,…) es necesario usar células vivas suspendiéndolas en un medio fisiológicamente correcto y examinarlas lo antes posible, sin embargo esta no es razón para que estas células vivas se puedan usar para otros estudios como marcaje extracelular o moléculas de adhesión. El PBS se usa frecuentemente para el mantenimiento celular in vitro de periodos breves pero si esto es para un periodo más largo es conveniente que contenga alguna proteína (HBSS o HEPES) para el mantenimiento del pH durante varias horas. Algunos medios de cultivo (ej. RPMI) también se pueden usar pero siempre que no contengan rojo fenol y mantenerlo a 5% de CO2 y con HEPES. Algunas proteínas adecuadas pueden ser 0.5-5% de BSA y 5-10% de FBS, además para estudios de marcaje inmunológico 1% de suero o 100 µg/ml o inmunoglobulina de la misma especie como anticuerpo primario.

Si las células (macrófagos, neutrófilos, plaquetas) tienden a agregarse pueden mantenerse en suspensión mediante medios libres de cationes divalentes (Ca2+ y mg2+) y si es necesario que contenga 5 mM de EDT, sin embargo ambas cosas son perjudiciales para la supervivencia celular.
Tratar las células con mucha delicadeza para perder el menor porcentaje posible.
Para una muestra más limpia y realmente ver las células que necesitamos es conveniente a veces hacer técnicas de aislamiento (centrifugación en gradiente de densidad, columnas) y/o depleción (ej. Sistema del complemento, bolas magnéticas) y/o lisis de eritrocitos.

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA CREAR EL SETTING

Crear la configuración de los láseres, es decir, usar unos laser u otros en función de los parámetros que vayamos a usar en nuestro experimento u experimento similares sucesivos.
Preparar una plantilla o conjunto de gráficos (dot-plot, histogramas, density-plot,…) donde mostrar los datos (Fig.1).
Utilizar una población de células diana con un porcentaje alto a los anticuerpos que vamos a utilizar, por ejemplo órganos linfoides para CD4, CD8, CD19,…
Titulación de anticuerpos: incubar los anticuerpos que vamos a utilizar por separado en una población diana con un porcentaje lo más alto posible a distintas concentraciones (1/100, 1/200, 1/400,…) y determinar la concentración optima de ese anticuerpo concreto unido a un fluorocromo.

Preparar los siguientes tubos:
- Ejemplo para 3 colores (FITC, PE y APC):
- Un control negativo, por ejemplo células sin ningún marcaje o control de isotipo.
- Incubar un tubo con cada color que vayamos a utilizar por separado, nunca habrá dobles positivos.
- Mezclar los colores entre si (FITC+PE, FITC+PE+APC)
- Otro tubo incubando todos los colores a la vez (Fig. 2).

Figura 2.

También es recomendable usar un marcaje de descarte de muertas para ver las poblaciones más limpias ya que estas células emiten autofluorescencia.

Algunas veces es conveniente fijar las células y marcar antes o después de esa fijación. Es importante validar por comparación con células que han sido procesadas vivas y sin demora si los datos de esa fijación son correctos. Desafortunadamente puede afectar a la ultraestructura de leucocitos, aumentar la unión no especifica de anticuerpos, disminuir la antigenicidad y llevar a disminuir la unión del anticuerpo. Los fijadores más comunes son alcoholes, acetonas, formaldehidos, entre otros.